Abstrakcyjny
Do tej pory szybko rozprzestrzeniały się nowe „warianty obaw” SARS-CoV-2. Wszystkie zawierają wielokrotne mutacje w miejscu rozpoznawania receptora ACE2 białka wypustek, w porównaniu z oryginalną sekwencją Wuhan, która jest bardzo niepokojąca ze względu na ich potencjał do ucieczki immunologicznej. Tutaj opisujemy skuteczność mniszka lekarskiego ( Taraxacum officinale) w celu zablokowania interakcji białko-białko kolca SARS-COV-2 z ludzkim receptorem ACE2. Można to wykazać dla postaci typu dzikiego i zmutowanych (D614G, N501Y i mieszanka K417N, E484K i N501Y) w ludzkich komórkach nerki HEK293-hACE2 i A549-hACE2-TMPRSS2 płuc. Za ten efekt odpowiadają związki o dużej masie cząsteczkowej zawarte w wodnym ekstrakcie. Ekstrakt skutecznie zapobiegał zakażeniu komórek płuc SARS-CoV-2 pik D614 i odmianą pseudotypowanego lentiwirusa Delta (B.1.617.2), podobnie jak wywoływane przez wirus wydzielanie prozapalnej interleukiny 6. Współczesne monografie zielarskie uznają stosowanie tej rośliny leczniczej za bezpieczne. Zatem,
1. Wstęp
Pod koniec 2019 roku po raz pierwszy zgłoszono chorobę znaną jako Corona Virus Disease 2019 lub COVID-19 [ 1 ]. Jest wywoływany przez koronawirusa 2 zespołu ostrej ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2). Suchy kaszel, gorączka, zmęczenie, bóle głowy, bóle mięśni i biegunka to częste objawy choroby. W ciężkich przypadkach ludzie mogą poważnie zachorować z zespołem ostrej niewydolności oddechowej [ 2]. Powierzchnia wirusa SARS-CoV-2 jest pokryta dużą liczbą glikozylowanych białek S, które składają się z dwóch podjednostek, S1 i S2. Podjednostka S1 rozpoznaje i przyłącza się do zakotwiczonego w błonie receptora enzymu konwertującego angiotensynę 2 (ACE2) karboksypeptydazy na powierzchni komórki gospodarza poprzez swoją domenę wiążącą receptor (RBD). Podjednostka S2 odgrywa kluczową rolę w pośredniczeniu w fuzji wirusa z komórką i we współpracy z podtypem 2 transbłonowej proteazy serynowej gospodarza (TMPRSS2) promuje wejście do komórki [ 3 ]. Ta interakcja między wirusem a komórką gospodarza w miejscu wejścia jest kluczowa dla początku i progresji choroby.
Do tej pory szybko rozprzestrzeniały się nowe warianty SARS-CoV-2, Alpha (wariant B.1.1.7), Beta (wariant B.1.351) i Gamma (wariant P.1). Delta (wariant B.1.617.2) pojawiła się niedawno i gwałtownie rozprzestrzeniła, zastępując Alfa na całym świecie. Większość z tych wariantów ma mutację N501Y w białku wypustek [ 4 ] i warianty SARS-CoV-2 z mutacjami białka wypustek D614G dominują obecnie na całym świecie. Wariant Beta zawiera, oprócz D614G, inne mutacje kolców, w tym trzy mutacje (K417N, E484K i N501Y) w RBD [ 5 ]. Wstępne dane sugerują możliwy związek między obserwowanym wzrostem śmiertelności a mutacją D614G i postawiono hipotezę, że zmiana konformacyjna w białku kolczastym powoduje wzrost zakaźności [ 6]. Obliczenia zaburzeń energii swobodnej dla interakcji mutacji N501Y i K417N zarówno z receptorem ACE2, jak i przeciwciałem pochodzącym od pacjentów z COVID-19 rodzą ważne pytania dotyczące możliwej odpowiedzi immunologicznej człowieka i sukcesu już dostępnych szczepionek [ 7 ]. Ponadto donoszono o zwiększonej oporności wariantów beta i alfa na neutralizację przeciwciał; w przypadku wariantu Beta było to w dużej mierze spowodowane mutacją E484K w białku wypustek [ 8 ]. Wariant Delta jest związany z cięższą chorobą, zwiększoną transmisją i przełomowymi infekcjami u osób zaszczepionych [ 9 , 10 , 11 , 12 ]. Liu i in. [ 13] odkryli, że mutacja szczytowa P681R wariantów wzmacnia przetwarzanie impulsów, co prowadzi do zwiększonej zgodności SARS-CoV-2 w porównaniu z wariantem alfa.
Ingerencja w miejsce interakcji między podjednostką kolca S1 a ACE2 może być głównym celem terapii lub profilaktyki [ 14 ]. Związki pochodzenia naturalnego mogą w tym przypadku zapewniać pewną ochronę przed wnikaniem do komórek wirusowych, nie wykazując przy tym żadnych skutków ubocznych lub wywołując ich niewiele. Tutaj opisujemy hamujący potencjał mniszka lekarskiego w wiązaniu białka wypustek S1 RBD z receptorem powierzchniowym komórki hACE2 i porównujemy wpływ oryginalnego białka wypustek D614 z jego D614G, N501Y i mieszanką (K417N, E484K i N501Y) mutacje.
Taraxacum officinale (L.) Weber z FHWigg. (mniszek pospolity) należy do rodziny roślin Asteraceae, podrodziny Cichorioideae z wieloma odmianami i mikrogatunkami. Jest to wieloletnie zioło, szeroko rozpowszechnione w cieplejszych strefach umiarkowanych półkuli północnej, zamieszkujące pola uprawne, pobocza dróg i tereny wiejskie. T. officinale jest spożywany jako pokarm, ale także stosowany w europejskiej fitoterapii przy schorzeniach wątroby, pęcherzyka żółciowego i przewodu pokarmowego lub przy schorzeniach reumatycznych. Współczesne monografie zielarskie uznają stosowanie roślin za bezpieczne i oceniają empiryczne stosowanie T. officinale w przypadku kamieni żółciowych lub chorób dróg żółciowych z pozytywnym wynikiem. Wskazania terapeutyczne do stosowania T. officinalesą wymienione w monografiach Niemieckiej Komisji E, Europejskiej Spółdzielni Naukowej ds. Fitoterapii (ESCOP) [ 15 , 16 ] oraz przez Brytyjskie Stowarzyszenie Medycyny Ziołowej [ 17 ]. Roślina zawiera szeroką gamę fitochemikaliów, w tym terpeny (laktony seskwiterpenowe, takie jak kwas taraxinowy i triterpeny), związki fenolowe (kwasy fenolowe, flawonoidy i kumaryny), a także polisacharydy [ 18 ]. Stwierdzono, że dominującym związkiem fenolowym jest kwas cykorowy (kwas dikawoilowinowy). Pozostałe składniki to kwasy mono- i dikawoilochinowy, pochodne kwasu winowego, flawon i glikozydy flawonolu. Korzenie, oprócz tych klas związków, zawierają duże ilości inuliny [ 19]. Formy dawkowania obejmują wodny wywar i napar, wyciskany sok ze świeżych roślin i nalewkę wodno-alkoholową oraz tabletki powlekane z suszonych ekstraktów stosowane jako monopreparaty [ 20 ], ale także integralne składniki leków farmaceutycznych. Celem pracy było zbadanie, czy wodne ekstrakty z liści T. officinale i jego wysokocząsteczkowe składniki blokują oddziaływanie receptora ACE2 z białkiem wypustkowym SARS-CoV-2.
2. Wyniki
2.1. Analiza chemiczna ekstraktu z liści T. officinale
Oparte na metabolizmie odciski palców T. officinale i Cichorium intybus L., ekstraktu z liści przeprowadzono za pomocą nieukierunkowanej analizy UPLC-TOF-MS (Rysunek 1) i domniemanego metabolitu identyfikacja została przeprowadzona przez przeszukanie bazy danych dokładnych wzorców mas i fragmentacji MS e . Do wstępnej adnotacji wykorzystano FoodDB, Plant Metabolic Network, PlantCyc i Nature Chemistry. Zidentyfikowano najliczniejsze związki tych ekstraktów zarówno w trybie jonów ujemnych (ESI-), jak i dodatnich (ESI+) ( tabele uzupełniające S1–S4 ). Są one głównie zgodne z wcześniejszymi doniesieniami [ 18 , 19 , 21 ].
2.2. T. officinale hamuje wiązanie RBD–ACE2 z kolcami
Najpierw zbadaliśmy hamowanie interakcji między białkiem kolczastym SARS-CoV-2 RBD i ACE2 przy użyciu ekstraktów z liści T. officinale . WRysunek 2A, podano zależne od stężenia hamowanie wiązania Spike S1–ACE2 po leczeniu ekstraktem T. officinale (EC50 = 14,9 mg/ml). Ekstrakty z C. intybus, innej rośliny z rodziny Asteraceae, również wykazywały zależne od stężenia hamowanie wiązania, ale z mniejszą siłą (EC50 = 31,4 mg/ml) (Rysunek 2B). Następnie przygotowaliśmy dwie frakcje ekstraktów, rozdzielając je na frakcję wysokocząsteczkową (>5kDa) i niskocząsteczkową (<5kDa). Jak widać zRysunek 2C–D, związki bioaktywne były obecne głównie we frakcji HMW. Tylko niewielką aktywność zaobserwowano we frakcji LMW.
Wpływ ekstraktów T. officinale i C. intybus na hamowanie SARS-CoV-2-Spike-ACE 2. ( A , B ) Zależne od stężenia działanie ekstraktów T. officinale (TO) i C. intybus (CI). ( C , D). Wpływ frakcji z ekstraktu z liści TO i CI. Ekstrakty liofilizowano, a następnie przeprowadzono frakcjonowanie według masy cząsteczkowej. Wartość odcięcia ustalono na 5 kDa (HMW > 5 kDa, LMW < 5 kDa). H+L: frakcje HMW i LMW; Jako odniesienie zastosowano 50 mg suszonych liści na ml wody. Zastosowano ilości frakcji HMW i LMW równoważne suszonym liściom. Hamowanie wiązania oceniano techniką ELISA. Słupki to średnie + SD. Kontrola rozpuszczalnika: woda destylowana (ad); * p < 0,05, ** p < 0,01. Istotność różnicy obliczono w stosunku do kontroli rozpuszczalnika za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA.
Stosując komórki HEK293 wykazujące nadekspresję hACE2, dalej badano potencjał ekstraktów do blokowania wiązania kolców z komórkami. Jak widać zRysunek 3, preinkubacja komórek z T. officinale przez jedną minutę skutecznie blokowała wiązanie komórek kolca o 76,67% ± 2,9, a jego frakcję HMW o 62,5 ± 13,4% w porównaniu z kontrolą wodną. Ekstrakt z C. intybus był słabszy; hamowanie wiązania zaobserwowano przy 37 ± 20% po 1 min.
Hamowanie wiązania białka wypustek S1 z ludzkimi komórkami HEK293-hACE2 przez wstępną inkubację ekstraktu. Komórki wstępnie inkubowano przez wskazany czas z 10 mg/ml T. officinale (TO), jego frakcją HMW równą 10 mg/ml ekstraktu (HMW) i 10 mg/ml C. intybus (CI) lub kontrolą rozpuszczalnika (ad) a następnie traktowany znakowanym His białkiem wypustek S1 przez 1 h bez etapu płukania pomiędzy w 4°C. Hamowanie wiązania oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. N= 3, słupki to średnie + SD. U góry po lewej: cytogram bramkowanych komórek HEK-hACE2. Środek: nałożenie reprezentatywnych histogramów intensywności fluorescencji dla ekspresji powierzchniowej ACE2. U góry po prawej: nałożenie reprezentatywnych histogramów intensywności fluorescencji dla hamowania wiązania kolców przez ekstrakty lub ad; kontrola pozytywna: 20 µg/ml rozpuszczalnego hACE2. Komórki barwiono przeciwciałem monoklonalnym anty-His-tag Alexa Fluor 647; ** p < 0,01. Istotność różnicy obliczono w stosunku do kontroli rozpuszczalnika za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA.
Traktowanie komórek równymi ilościami kolców D614 i jego wariantów D614G i N501Y potwierdziło silniejsze powinowactwo wiązania D614G (około 1,5-krotnie) i N501Y (około 3- do 4-krotnie) niż białko wypustek D614 z receptorem powierzchniowym ACE2 komórek HEK293 (Rysunek 4A). Wstępne leczenie T. officinale szybko (w ciągu 30 s) zablokowało wiązanie kolców z receptorem powierzchniowym ACE2 (Rysunek 4PNE). Po 30 s było to 58,2 ± 28,7% dla D614, 88,2 ± 4,6% dla D614G i 88 ± 1,3% dla hamowania wiązania N501Y przez ekstrakt T. officinale . Mimo że w przypadku ekstraktu z C. intybus można było zaobserwować hamowanie wiązania wypustek, było to około 30–70% mniej w porównaniu z T. officinale , w zależności od badanego białka wypustek. Gdy wiązanie badano w 37 °C zamiast 4 °C, wyniki były porównywalne dla T. officinale , ale jeszcze słabsze dla ekstraktu C. intybus w tej linii komórkowej (Rysunek 4D). Podnieśliśmy również pytanie, czy ekstrakty mogą zastąpić wiązanie kolców z receptorem powierzchniowym ACE2 komórek ludzkich. W tym celu najpierw inkubowaliśmy komórki z białkiem wypustkowym D614, D614G lub N501Y, a następnie z ekstraktami. Jak widać wRysunek 4D, T. officinale mogą silnie usuwać kolce z receptora (średnio 50%); C. intybus był znacznie słabszy niż (średnio 25%). Rozszerzyliśmy nasze eksperymenty na ludzkie komórki A549-hACE2-TMPRSS2 i mogliśmy potwierdzić wyniki obserwowane w komórkach HEK293-hACE2 dla T. officinale (Rysunek 4D–G). Ta linia komórkowa została stabilnie transfekowana zarówno ludzkimi genami ACE2 jak i TMPRSS2 i co ciekawe, tutaj ekstrakt C. intybus był bardziej skuteczny w porównaniu z komórkami HEK-hACE2. Po wstępnej obróbce ekstraktem hamowanie wiązania kolców do komórek wynosiło od 73,5% ± 5,2 (D614) do 86,3% ± 3,23 (N501Y) dla ekstraktu T. officinale i 56,1% ± 5,28 (D614) do 63,07% ± 14,55 (N501Y) ) dla wyciągu z C. intybus . Już przy 0,6 mg/ml T. officinale istotnie blokowało wiązanie z białkiem wypustek D614G o około 40% (IC50 = 1,73 mg/ml). Gdy komórki były wstępnie inkubowane z białkiem wypustek przed traktowaniem ekstraktem, wyniki były porównywalne dla ekstraktu T. officinale dla D614 i D614G, ale nieco niższe dla N501Y (Rysunek 4PŁYTA CD). Również w tym ustawieniu przetestowano mieszaninę mutantów kolczastych N501Y, K417N i E484K i tutaj ponownie ekstrakt T. officinale zablokował wiązanie o 82,97% ± 6,31 (ekstrakt przed inkubacją) i 79,7% ± 9,15 (ekstrakt po inkubacja). Ekstrakty, inkubowane w ludzkiej ślinie przez 30 minut w temperaturze 37 °C przed potraktowaniem komórek, miały porównywalny wpływ na hamowanie kolców D614G (Rysunek 4H) wskazujący na dobrą stabilność związków bioaktywnych w ślinie.
Hamowanie wiązania kolca D614 i jego mutantów D614G, N501Y lub mieszanki (N501Y, K417N i E484K) z ludzkimi komórkami HEK293-hACE2 i A549-hACE2-TMPRSS2 przez ekstrakcję przed lub po inkubacji. Nałożenie histogramu intensywności fluorescencji dla ( A ) niewybarwionych komórek HEK, kontroli barwienia (anty-His-tag Alexa Fluor 647) i komórek inkubowanych ze znakowanym His-tagiem kolcem D614, D614G lub N501Y przez 1 godzinę w 4°C. ( B , C ) komórki wstępnie inkubowane z kontrolą rozpuszczalnika (ad), 10 mg/ml T. officinale (TO) lub 10 mg/ml C. intybus (CI) przez 30–60 s, a następnie traktowane znacznikiem His -znakowane S1 kolce białkowe D614, D614G lub N501Y przez 1 h bez etapu płukania w temperaturze 4 °C. ( D – G) Wpływ inkubacji ekstraktu na komórki HEK lub A549 przed lub po inkubacji ze znakowanym His-tagiem kolcem D614, D614G, N501Y lub mieszanką białek (N501Y, K417N i E484K) w temperaturze 37 °C. ( H ) Ekstrakty roślinne inkubowano w ślinie od czterech ludzkich dawców przez 0,5 godziny w 37°C. Następnie komórki wstępnie traktowano 5 mg/ml ekstraktów przez 60 s w 37°C przed inkubacją z wyznakowanym His-tagiem białkiem wypustek D614 przez 0,5 godz. w 37°C. Hamowanie wiązania kolców do komórek ludzkich oceniano stosując analizę cytometrii przepływowej komórek barwionych przeciwciałem monoklonalnym anty-His-tag Alexa Fluor 647 skoniugowanym. Słupki oznaczają średnie +SD; * p < 0,05, ** p < 0,01. Istotność różnicy obliczono w stosunku do odpowiedniej kontroli rozpuszczalnika za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA.
2.3. T. officinale nie zakłóca aktywności enzymu ACE2
Aby sprawdzić, czy ekstrakt T. officinale zakłóca aktywność katalityczną receptora ACE2 lub wpływa na ekspresję białka ACE2, potraktowaliśmy komórki A549-hACE2-TMPRSS2 ekstraktem przez 1–24 godziny przed lizą komórek i wykryciem. Nie zaobserwowano utraty żywotności komórek po ekspozycji ekstraktu na komórki przez 84 godziny (Rysunek 5A). Po 1 lub 24 godzinach nie można było wykryć upośledzenia aktywności enzymów (Rysunek 5B). Skok znacząco obniżył poziom białka ACE2 po 6 godzinach (Rysunek 5C, czarne słupki), dotyczyło to również samego ekstraktu (Rysunek 5C, białe paski) lub w połączeniu z kolcem (czarne paski). Po 24 h efekt ten zniknął (Rysunek 5D).
Wpływ ekstraktu T. officinale na aktywność enzymu ACE2 i ekspresję białek. ( A ) Żywotność komórek A549-hACE2-TMPRSS2 określono przy użyciu barwienia komórek błękitem trypanu po 84 godzinach ekspozycji na ekstrakt. ( B ) Komórki inkubowano z ekstraktem TO lub 500 ng/ml białka S1 i analizowano pod kątem aktywności enzymatycznej przy użyciu zestawu fluorescencyjnego. ( C , D ) Komórki eksponowano przez 6 godzin lub 24 godziny na ekstrakcję bez (białe słupki) lub z (czarne słupki) 500 ng/ml białka S1 i analizowano pod kątem ekspresji białka ACE2 przy użyciu ludzkiego zestawu ACE2 ELISA; ad: kontrola rozpuszczalnika. Słupki oznaczają średnie + SD, N ≥ 3 niezależne eksperymenty; * p < 0,05, ** p< 0,01. Istotność różnicy obliczono w stosunku do odpowiedniej kontroli za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA.
2.4. T. officinale blokuje SARS-CoV-2 Spike D614 i Spike Delta (B.1.617.2) Wariant transdukcji pseudotypowanego lentiwirusa
Używając SARS-CoV-2 spike D614 i spike Delta (B.1.617.2) wariant pseudotypowanego lentiwirusa, zbadaliśmy następnie, czy ekstrakt może blokować wejście wirusa poprzez hamowanie spike. Po wstępnym potraktowaniu ekstraktem transdukcja wirusa kolca D614 została zmniejszona o około 85% przy 20 mg/ml, co mieściło się w zakresie hamowania obserwowanego przez 0,35 mg/ml ekstraktu HMW (Rysunek 6Lewa). Jak pokazano wRysunek 6A (po prawej), znaczne zmniejszenie zakażenia komórek płuc wariantem Delta pseudowirusem zaobserwowano również po leczeniu ekstraktami z T. officinale lub ekstraktem HMW (odpowiednio 72% przy 20 mg/ml i 69% przy 0,35 mg/ml). ). Przeciwciało anty-hACE2, które zastosowano tutaj jako odniesienie, zablokowało transdukcję wirusa o 74% przy 100 µg/ml.
Hamowanie transdukcji wirusowej komórek A549-hACE2-TMPRSS2 przez ekstrakt z T. officinale . ( A ) Komórki wstępnie traktowano T. officinale (TO) lub ekstraktem HMW przez 0,5 godziny przed infekcją 7500 TU/ml SARS-CoV-2 spike D614 lub wariantem Delta (B.1.617.2) przez 24 godziny; ( B , C ) Komórki transdukowano 7500 TU/ml SARS-CoV-2 przez (B) 3 godziny przed dodaniem TO przez kolejne 21 godzin lub (C) 24 godziny. Po transdukcji pożywkę wymieniono na świeżą pożywkę zawierającą ekstrakt TO lub HMW we wskazanych stężeniach i inkubowano przez 60 godzin. ( D) Komórki wstępnie traktowano 40 mg/ml TO przez 3 godziny przed transdukcją wskazanym mianem wirusa przez 24 godziny. Następnie pożywkę wymieniono na świeżą i inkubowano przez kolejne 48 godzin. Następnie w ciągu 1 godziny wykryto luminescencję. 0,35 mg/ml ekstraktu HMW równa się 20 mg/ml ekstraktu TO. Kontrola transdukcji: (-) kontrola negatywna: łysy pseudowirion lentiwirusowy; (+) kontrola pozytywna: lentiwirus świetlika lucyferazy; kontrola pozytywna inhibitora: 100 µg/ml przeciwciała anty-hACE2. ( E) Analizę wydzielania prozapalnej cytokiny IL-6 wykonano albo po 24 h transdukcji wirusa wraz z ekstraktem (po lewej), po 24 h + 60 h po zakażeniu ekstraktem (środek) lub po 60 h po zakażeniu ekstraktem (po prawej ) za pomocą multipleksowej analizy cytometrii przepływowej. Kontrola rozpuszczalnika: woda destylowana (ad). N ≥ 3 niezależne eksperymenty; * p < 0,05, ** p < 0,01. Istotność różnicy obliczono w stosunku do kontroli rozpuszczalnika za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA.
Aby zbadać, który etap infekcji pseudowirusem SARS-CoV-2 był celem ekstraktu, leczyliśmy komórki w różnych punktach czasowych, na przykład przed (przed leczeniem), w trakcie (wspólne leczenie) lub po (po leczeniu) Infekcja wirusowa. W różnych warunkach leczenia, sygnał luminescencyjny wytwarzany przez transdukcję wirusa kolca D614 był hamowany przy stężeniu 10 mg/ml ekstraktu o 70% ± 16,7 (A), 58% ± 9,6 (B) i 53% ± 8,1 (C). Poza tym zajęliśmy się skutecznością zapobiegania zakażeniom w komórkach bez infekcji po zakażeniu. Widać to zRysunek 6D że, w zależności od początkowego obciążenia wirusem, infekcja zmniejszyła się o > 43% przy 1500 TU/ml i 35% przy 3000 TU/ml, podczas gdy była minimalna zmiana przy 7500 TU/ml. 36% zahamowanie zostało osiągnięte przez ekstrakt roślinny w komórkach transdukowanych wariantem delta SARS-CoV-2 w stężeniu 1500 TU/mL (Rysunek 6D, po prawej). Zahamowanie transdukcji wirusa przez ekstrakt wiązało się ze znacznym zahamowaniem odpowiedzi zapalnej wywołanej przez wirusa, co określono na podstawie zmniejszonego wydzielania prozapalnej cytokiny IL-6 w komórkach A549-hACE2-TMPRSS2 (Rysunek 6MI).
3. Dyskusja
Opracowanie skutecznych strategii zapobiegania i leczenia infekcji SARS-CoV-2 pozostaje wyzwaniem, ponieważ pojawiają się nowe warianty, które prawdopodobnie będą bardziej zaraźliwe i lepiej umykają układowi odpornościowemu. Chociaż pierwsze szczepionki uzyskały już pozwolenie na dopuszczenie do obrotu, wyzwania związane z dystrybucją i obawy dotyczące trwałej skuteczności i ryzyka ponownego zakażenia pozostają [ 22 ]. Odnotowano już przełomowe infekcje szczepionkowe, zwłaszcza transmisję z wariantem Delta [ 9 , 11 , 12 ]. Sugeruje to potencjalne osłabienie ochronnego działania szczepionek przeciwko infekcjom Sars-CoV-2 [ 23 , 24]. Kolejne infekcje mogą jednak być łagodniejsze niż pierwsze. Szczepienia przypominające w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej mogą być najlepszą strategią zmniejszenia ryzyka. Oprócz szczepienia, alternatywną strategią zapobiegania COVID-19 jest blokowanie dostępu wirusa do związanego z błoną ACE2 jako głównego receptora dla wejścia komórek docelowych SARS-CoV-2. W tym przypadku istnieją różne podejścia [ 25 ], ale oczywiście każda z tych strategii leczenia ma również swoje podstawowe i translacyjne wyzwania, które należy przezwyciężyć, aby uzyskać przydatność kliniczną. Przeszkody techniczne obejmują potencjał poza docelowym, efekty niezależne od ACE2, stabilność lub toksyczność [ 25]. Związki pochodzenia naturalnego mogą być tutaj ważnym zasobem, ponieważ zostały już dobrze opisane, a wiele z nich uznano za bezpieczne. Podczas gdy eksperymenty z dokowaniem in silico sugerowały różne powszechne związki naturalne jako inhibitory ACE2, jak dotąd nie wykazano hamowania wiązania kolców z ACE2 dla większości z nich, co można wyjaśnić brakiem pełnego pokrycia reszt wiążących ACE2 przez te związki [ 26 ]. ]. Jednak w przypadku glicyryzyny, nobiletyny i neohesperydyny wiązanie ACE2 mieści się częściowo w obszarze kontaktu RBD, a zatem zaproponowano, aby dodatkowo blokowały wiązanie wypustek z ACE2 [ 20 ]. To samo dotyczy syntetycznych inhibitorów ACE2, takich jak N- (2-aminoetylo)-1 azyrydyno-etanoamina [ 27]. W przeciwieństwie do tego, antybiotyk lipoglikopeptydowy dalbawancyna został obecnie zidentyfikowany zarówno jako środek wiążący ACE2, jak i inhibitor ACE2 dla SARS-CoV-2 [ 28 ]; Zakażenie SARS-CoV-2 było skutecznie hamowane przez ten związek zarówno w modelu myszy, jak i makaka rezus. Ponadto, w przypadku ekstraktu ze skórki wodno-alkoholowego granatu, blokowanie interakcji kolca-ACE2 wykazano w 74%, dla jej głównych składników punikalaginy w 64%, a kwasu elagowego w 36%. Używając spike pseudotypowanego lentiwirusa SARS-CoV-2 infekcja komórek ludzkiej nerki-2, wnikanie wirusa było następnie skutecznie blokowane przez ekstrakt ze skórki [ 29 ]. W niniejszym badaniu mogliśmy wykazać silną inhibicję białka S1 RBD ACE2 przez kolce T. officinaleekstrakty przy użyciu testu bezkomórkowego i potwierdził to odkrycie, wykazując skuteczne hamowanie wiązania powierzchni komórek ACE2 w dwóch ludzkich liniach komórkowych. Zaobserwowaliśmy silniejsze wiązanie wariantów D614G i N501Y z receptorem powierzchniowym ACE2 komórek ludzkich, ale wszystkie testowane warianty były wrażliwe na hamowanie wiązania przez T. officinale , stosowane albo przed ekspozycją na białko wypustek, albo po. Do chwili obecnej kilka badań wskazuje, że linia wirusa D614G jest bardziej zakaźna niż wirus D614 [ 30 ]. Ponadto obecność charakterystycznych mutacji, takich jak N501Y, skutkuje wyższą zakaźnością niż szczep macierzysty, co może wynikać z większego powinowactwa wiązania między białkiem wypustkowym a ACE2 [ 31 ]. Więc nasze odkrycia dotyczące T. officinaleekstrakty mogą być tutaj ważne, ponieważ wraz z postępem pandemii pojawią się nowe warianty wirusów, które mogą stanowić potencjalne zagrożenie, które mogą również zmniejszać skuteczność niektórych szczepionek lub powodować zwiększone wskaźniki reinfekcji. Jak wspomniano powyżej, problemem przy opracowywaniu produktów, takich jak profilaktyka infekcji SARS-CoV-2 lub spowalnianie ogólnoustrojowego rozprzestrzeniania się wirusa, jest selektywność w kierunku wtargnięcia wirusa przy niskiej toksyczności potrzebnej gospodarzowi. W przypadku aktualnych wskazań medycznych nie zgłoszono żadnego przypadku przedawkowania T. officinale [ 15 , 17 , 20 ].]. Zalecana dawka to 4–10 g (około 20–30 mg na ml gorącej wody) do trzech razy dziennie (Commission E i ESCOP). Na podstawie informacji dostarczonych przez Europejską Agencję Leków przeciwwskazaniami do stosowania T. officinale są nadwrażliwość na rośliny z rodziny Asteraceae lub ich substancje czynne, choroby wątroby i dróg żółciowych, w tym niedrożność dróg żółciowych, kamica żółciowa i zapalenie dróg żółciowych, czy czynna choroba wrzodowa [ 20 ]. Roślina jest znaczącym źródłem potasu [ 32 ] i dlatego ostrzega się przed możliwym ryzykiem hiperkaliemii. Ze względu na brak odpowiednich lub wystarczających danych nie ustalono stosowania u dzieci w wieku poniżej 12 lat lub w okresie ciąży i laktacji.
Podczas gdy ekstrakt T. officinale nie miał wpływu na aktywność enzymu ACE2 w niniejszym badaniu, białko ACE2 było przejściowo obniżone w linii komórkowej płuc z nadekspresją ACE2. ACE2 odgrywa kluczową rolę w zakażeniu SARS-CoV-2, więc obniżenie poziomu ACE2 może teoretycznie zapewnić pewną początkową ochronę [ 33 ]. Może to jednak również wpływać na ważne funkcje fizjologiczne komórki. ACE2 jest ważną monokarboksypeptydazą zależną od cynku w szlaku renina-angiotensyna, mającym kluczowe znaczenie w oddziaływaniu na układ sercowo-naczyniowy i odpornościowy. Zakłócenie równowagi angiotensyna II/angiotensyna-(1-7) poprzez zahamowanie aktywności enzymu ACE2 lub zmniejszenie białka i zwiększenie ilości krążącej angiotensyny II w układzie, sprzyja uszkodzeniu płuc w kontekście choroby COVID-19 [ 34 ]]. Dlatego obserwacja ta wymaga większej uwagi w trwających badaniach.
Można założyć, że płuco jest głównym obiektem zainteresowania, ale mRNA ACE2 i ekspresję białek stwierdzono w komórkach nabłonkowych wszystkich tkanek jamy ustnej, zwłaszcza w błonie śluzowej policzka, wardze i języku [ 35 ]. Dane te są zgodne z obserwacją bardzo wysokiego miana wirusa w ślinie u pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 [ 36 , 37 ]. Uważa się zatem, że jama ustna, jako zasadnicza część górnego odcinka przewodu pokarmowego, odgrywa kluczową rolę w przenoszeniu i patogeniczności SARS-CoV-2. Istnieje duży potencjał, że zapobieganie kolonizacji wirusowej błony śluzowej jamy ustnej i gardła może mieć kluczowe znaczenie dla zapobiegania dalszym zakażeniom innych narządów i wystąpieniu COVID-19 [ 38 ].]. Sugerowano zatem, że komercyjne wirusobójcze płukanki do ust, na pierwszym miejscu powidon-jod, mogą potencjalnie zmniejszyć obciążenie wirusem SARS-CoV-2 u zakażonych osób [ 39 , 40 ], ale do tej pory nie istnieją żadne znaczące badania kliniczne [ 40 ] . . Zablokowanie wiązania wirusa SARS-CoV-2 z komórkami jamy ustnej za pomocą ekstraktów T. officinale może być tolerowane przez konsumenta, w razie potrzeby tylko przez ograniczony czas (np. stosowanie produktu po kontakcie z osobami zakażonymi lub w przypadku zarażenia). Przeprowadzone przez nas bardziej fizjologicznie istotne doświadczenia in vitro wykazały, że tylko krótkie czasy kontaktu z T. officinaleekstrakty były niezbędne do skutecznego blokowania wiązania wypustek SARS-CoV-2 lub do usuwania już związanych wypustek z powierzchni komórki. Dalsze dowody na znaczenie zostały dostarczone przez wykazanie skutecznej ochrony T. officinale przed infekcją wirusem pseudotypowanym SARS-CoV-2 D614 i wariantem Delta ludzkich komórek płuc. Wykorzystanie pseudotypowanych wirusów nie pozwala na ocenę wkładu właściwości wirionów, takich jak białka błony lub otoczki, w tropizm komórkowy [ 35 ]. Jednak dane dotyczące pseudowirusów są uważane za przydatne narzędzie do dokumentowania znaczenia ACE2 na etapach wnikania do komórki, w których pośredniczą białka wypustek.
4. Materiały i metody
4.1. Materiał roślinny
Badania przeprowadzono na suszonych liściach T. officinale (vom Achterhof, Uplengen, Niemcy; partia nr 37259, B370244 i P351756). C. intybus zakupiono w Naturideen (Niemcy).
4.2. Ekstrakcja roślin
Wysuszony materiał roślinny odważono w fiolce z oranżowego szkła (Carl Roth GmbH, Niemcy) i zmieszano z wodą o czystości HPLC (ad) w temperaturze pokojowej (RT). Ekstrakty następnie inkubowano przez 1 godzinę i odwirowano przy 16 000 g (3 min, RT). Supernatant przesączono (0,22 µm) przed użyciem do eksperymentów.
4.3. Ultrawydajna chromatografia cieczowa (UPLC)-czas przelotu (TOF)-spektrometria mas
Widma masowe o wysokiej rozdzielczości rejestrowano na spektrometrze masowym Waters Synapt G2-S HDMS (Waters, Manchester, Wielka Brytania) sprzężonym z systemem rdzeniowym Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, USA) składającym się z menedżera rozpuszczalników binarnych, menedżera próbek i piec kolumnowy. W celu przeszukiwania ekstraktów porcje (5 µl) wszystkich próbek wstrzyknięto do systemu UPLC-TOF-MS przy użyciu kolumny BEH C18 (150 mm × 2,1 mm, 1,7 µm, Waters), działającej przy natężeniu przepływu 0,4 ml/ min w 45 °C. Rozdział chromatograficzny przeprowadzono z gradientem wodnego kwasu mrówkowego (0,1%, A) i acetonitrylu (0,1%, B). Gradient rozpoczął się od mieszaniny 1% B i utrzymywano izokratycznie przez 1 minutę, następnie zwiększono do 100% B w ciągu 9 minut i utrzymywano przy 100% B przez 1 dodatkową minutę. Pomiary przeprowadzono w trybie wysokiej rozdzielczości z ujemną jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI−) i dodatnią jonizacją przez elektrorozpylanie (ESI+). Parametry źródła jonów były następujące: napięcie kapilarne +2,5 kV (ESI+) lub -2,5 kV (ESI−), stożek próbkowania 50 V, przesunięcie źródła 30 V, temperatura źródła 150 °C, temperatura desolwatacji 450 °C, gaz stożkowy 2 l/h, przepływ gazu nebulizatora 6,5 bara, a gaz desolwatacyjny 850 l/h. Przetwarzanie danych było obsługiwane za pomocą MassLynx 4.1 (Waters) i Progenisis QI (Waters).
4.4. Linie komórkowe i warunki hodowli
Ludzkie embrionalne komórki nerki 293 (HEK293), stabilnie eksprymujące hACE2, zostały hojnie dostarczone przez prof. dr Stefana Pöhlmanna (Göttingen, Niemcy). Komórki utrzymywano w pożywce Eagle w modyfikacji Dulbecco (DMEM), z wysoką zawartością glukozy uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 50 ug/ml zeocyny (Life Technologies, Darmstadt, Niemcy). Ludzkie komórki A549-hACE2-TMPRSS2, wytworzone z ludzkiej linii komórkowej płuca A549 zakupiono od InvivoGen SAS (Toulouse Cedex 4, Francja) i utrzymywano w DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS, 100 U/ml penicyliny/ streptomycyna, 100 µg/ml normocyny, 0,5 µg/ml puromycyny i 300 µg/ml higromycyny. W celu przeprowadzenia subkultury, wszystkie komórki najpierw przepłukano solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie inkubowano z 0,25% trypsyną-EDTA aż do oddzielenia.
4.5. Analiza hamowania interakcji SARS-COV2 Spike-ACE2 za pomocą testu ELISA i cytometrii przepływowej
Dostępny w handlu zestaw przesiewowy inhibitorów SARS-CoV-2 (nr kat.: 16605302, Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Niemcy) zastosowano do bezkomórkowego wykrywania hamowania interakcji SARS-CoV-2 Spike-ACE2. Ten kolorymetryczny test ELISA mierzy wiązanie pomiędzy unieruchomionym białkiem wypustek SARS-CoV-2 RBD i biotynylowanym ludzkim białkiem ACE2. Detekcja kolorymetryczna jest wykonywana przy użyciu streptawidyny-HRP, a następnie inkubacji TMB. Jako sprawdzone metody odniesienia zastosowano inhibitor SARS-CoV-2 (hACE2). % hamowania obliczono w stosunku do kontroli rozpuszczalnika (woda destylowana, ad).
Ekspresję ACE2 na powierzchni komórek określono przy użyciu ludzkiego przeciwciała skoniugowanego z ACE2 PE (Bio-Techne GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt, Niemcy) i analizy metodą cytometrii przepływowej. Do analizy wiązania SARS-CoV-2 S1 Spike RBD-ACE2, 2 × 105 komórek (5 × 10 6komórek/ml) wstępnie potraktowano ekstraktami roślinnymi w różnych punktach czasowych. Następnie 500 ng/ml SARS-CoV-2 Spike S1 (Trenzyme GmbH, Konstanz, Niemcy), spike S1 D614G, N50Y lub mieszanka K417N, E484K i N501Y (Sino Biological Europe GmbH, Eschborn, Niemcy) – His do każdej próbki dodano zrekombinowane białko i próbki dalej inkubowano przez 30-60 min. W innym ustawieniu komórki wstępnie traktowano 500 ng/ml rekombinowanego białka SARS-CoV-2 Spike-His przez 30 minut przed inkubacją z ekstraktem roślinnym przez 30–60 s w temperaturze 4 °C lub 37 °C. Próbki inkubowano w buforze PBS zawierającym 5% FBS. Komórki następnie przemywano jeden raz buforem PBS zawierającym 1% FBS przy 500 g, 5 min przed barwieniem mAb His-tag A647 (Bio-Techne GmbH, Wiesbaden-Nordenstadt, Niemcy) przez 30 min w RT. Następnie komórki przemyto dwukrotnie, jak opisano powyżej. Komórki analizowano przy użyciu FACSCalibur (BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy); Zebrano 10 000 wydarzeń. Medianę intensywności fluorescencji (MFI) każdej próbki określono przy użyciu oprogramowania FlowJo (Ashland, OR, USA). % hamowania wiązania kolców obliczono w odniesieniu do kontroli rozpuszczalnika (woda destylowana, ad).
4.6. Aktywność ludzkiego enzymu ACE2 i oznaczenie ilościowe białka
Komórki A549-hACE2-TMPRSS2 (2 x 105 ) wysiano na 24-studzienkowej płytce w pożywce DMEM o wysokiej zawartości glukozy, zawierającej 10% inaktywowanej termicznie FBS, w 37°C, 5% CO2 . Komórki następnie traktowano ekstraktem T. officinale z/bez 500 ng/ml białka SARS-CoV-2 S1 Spike RBD przez 1–24 godz. Następnie komórki przemyto PBS i poddano lizie. 25 ug białka zastosowano do ilościowego oznaczenia białka ACE2 (zestaw ACE2 ELISA), 5 ug dla aktywności enzymu ACE2 (zestaw do testu aktywności ACE2, Abcam, Cambridge, Wielka Brytania) zgodnie z instrukcjami producenta.
4.7. Zakażenie komórek A549-hACE2-TMPRSS2 przy użyciu SARS-CoV-2 Spike D614 i Delta (B.1.617.2) Wariant Pseudotypowanego Lentiwirusa
SARS-CoV-2 pik D614 i cząsteczki pseudotypowanego lentiwirusa wariantu Delta, wytworzone za pomocą piku SARS-CoV-2 i piku wariantu SARS-CoV-2 B.1.617.2 (nr dostępu Genbank QHD43416.1) jako glikoproteiny otoczki zamiast powszechnie stosowanego VSV-G, zakupiono od BPS Bioscience, (odpowiednio nr katalogowy: 79942 i katalog nr 78215, Biomol, Hamburg, Niemcy). Te pseudowiriony zawierają również gen lucyferazy świetlika kierowany przez promotor CMV. W związku z tym wejście do komórki za pośrednictwem impulsów można określić ilościowo poprzez aktywność reportera lucyferazy. Jako kontrolę negatywną zastosowano pseudowirion łysy lentiwirusowy (BPS Bioscience #79943), w którym nie zachodzi ekspresja glikoproteiny otoczki. Jako kontrolę pozytywną transdukcji zastosowano lentiwirus świetlika lucyferazy (Puromycin) firmy BPS Bioscience (nr katalogowy: 79692-P). Wirusy te konstytutywnie wyrażają lucyferazę świetlika pod promotorem CMV. Przeciwciało anty-hACE2 (Biomol, NSJ-F49433) zastosowano jako odniesienie do testu hamowania transdukcji. Komórki płuca wysiano w ilości 1 x 105 komórek / cm2 w 96-dołkowej płytce w DMEM zawierającej 10% inaktywowanej termicznie FBS, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 100 µg/ml normocyny, 0,5 µg/ml puromycyny i 300 µg/ml higromycyny i pozostawione na noc . Pożywkę zastąpiono pożywką DMEM zawierającą 10% inaktywowanej termicznie FBS i komórki albo wstępnie potraktowano ekstraktem T. officinale w różnych punktach czasowych przed dodaniem cząstek lentiwirusa lub odwrotnie. Po 24 godzinach inkubacji cząstek wirusa, pożywkę usunięto przez przemycie PBS, dodano świeżą pożywkę i komórki poddano dalszej transdukcji z/bez dodatku T. officinalewyciąg. Luminescencję wykryto w ciągu 1 godziny przy użyciu jednoetapowego odczynnika lucyferazy z BPS zgodnie z protokołem producenta w czytniku wielopłytkowym z Tecan (Tecan Group Ltd., Crailsheim, Niemcy); kontrola rozpuszczalnika: 10% woda destylowana (ad).
4.8. Ilościowa ocena uwalniania cytokin za pomocą techniki kulek multipleksowych
Po 24 godzinach transdukcji pseudotypowanego lentiwirusa SARS-CoV-2 i 60 godzin po zakażeniu komórek A549-hACE2-TMPRSS2, supernatanty zebrano i przechowywano w temperaturze -80 °C do czasu analizy wydzielania cytokiny przy użyciu zestawu 12 ludzkich cytokin MACSplex ( Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. Cytokiny poniżej granicy wykrywalności 3,2 pg/ml nie zostały uwzględnione w analizie.
4.9. Frakcjonowanie masy cząsteczkowej ekstraktów roślinnych
Ekstrakty z suszonych liści roślin przygotowano przez dodanie wody podwójnie destylowanej (5 ml) do materiału roślinnego (po 500 mg). Próbki inkubowano w ciemności w temperaturze pokojowej (RT) przez 60 min, a następnie odwirowano przy 16 000 g przez 3 min. Supernatanty zebrano i przefiltrowano przez membranę (0,45 µm), uzyskując ekstrakty. Próbki liofilizowano przez 48 godzin w celu określenia ich wydajności wagowej. Ekstrakty następnie rozdzielono na frakcję o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW) i niskiej masie cząsteczkowej (LMW), stosując probówkę wirówkową z wkładką zawierającą filtr odcinający masę cząsteczkową (5 kDa, Sartorius Stedim Biotech, Goettingen, Niemcy). . Każdą frakcję HMW oczyszczono przez spłukanie 20 ml wody, uzyskując frakcje HMW, a także LMW. Frakcje liofilizowano,
4.10. Oznaczanie żywotności komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym
Żywotność komórek oceniano za pomocą testu wykluczenia barwnika z błękitem trypanu, jak opisano wcześniej [ 41 ]. W skrócie, komórki A549-hACE2-TMPRSS2 hodowano przez 24 godziny, a następnie eksponowano na ekstrakty lub kontrolę rozpuszczalnika (ad) przez 84 godziny.
4.11. Analiza statystyczna
Wyniki analizowano przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA, USA). Dane przedstawiono jako średnie + SD. Istotność statystyczną określono za pomocą jednokierunkowego testu ANOVA, a następnie korekty Bonferroniego. Wartości p < 0,05 (*) uznano za istotne statystycznie, a < 0,01 (**) za wysoce istotne statystycznie.
5. Wnioski
Wszystkie opracowane kandydaci na szczepionki mają na celu wygenerowanie odpowiedzi przeciwciał (i komórek T) przeciwko białku wypustek, a sekwencje wypustek z wczesnego szczepu Wuhan posłużyły jako podstawa [ 42 ]. Jednak SARS-CoV-2 stale mutuje podczas ciągłej transmisji wśród ludzi. Dryf antygenowy wirusa jest wyraźnie widoczny w niedawnym pojawieniu się nowych wariantów. Ewoluuje w taki sposób, że może w końcu być w stanie ominąć nasze dotychczasowe podejścia terapeutyczne i profilaktyczne ukierunkowane na skok wirusa. Coraz więcej badań już donosi o zmniejszonej skuteczności przeciwciał neutralizujących przeciwko wariantowi SARS-CoV-2 Delta w porównaniu z jego pierwotną postacią [ 43 , 44 ]. Co ciekawe, T. officinalewykazał tylko nieznacznie mniejszą skuteczność przeciwko pseudotypowanemu wirusowi wariantu Delta in vitro, a ekstrakt roślinny wykazał również skuteczne hamowanie wiązania czterech istotnych mutacji wypustek z ludzkim receptorem ACE2. Może to być główną zaletą w zapobieganiu zakażeniu SARS-CoV-2. Zatem wyniki zachęcają do bardziej dogłębnej analizy skuteczności T. officinales i wymagają teraz dalszych potwierdzających dowodów klinicznych.
Materiały uzupełniające
Poniższe informacje są dostępne online pod adresem https://www.mdpi.com/article/10.3390/ph14101055/s1 , Tabela S1: Analiza chemiczna ekstraktu z liści T. officinale przy użyciu trybu jonów ujemnych UPLC-TOF-MS (ESI-), Tabela S2: Analiza chemiczna ekstraktu z liści T. officinale przy użyciu trybu jonów dodatnich UPLC-TOF-MS (ESI+). Tabela S3: Analiza chemiczna ekstraktu z liści C. intybus przy użyciu UPLC-TOF-MS w trybie jonów ujemnych (ESI-), Tabela S4: Analiza chemiczna ekstraktu z liści C. intybus przy użyciu UPLC-TOF-MS w trybie jonów dodatnich (ESI+).
Autorskie Wkłady
Konceptualizacja, EL; metodologia, HTTT; MG, EL i NPKL; walidacja, EL; HTTT; MG i NPKL; analiza formalna, EL; HTTT i MG; zasoby, EL i CD; pisanie — przygotowanie oryginalnego projektu, EL; pisanie — recenzja i edycja, EL, HTTT i MG; nadzór i pozyskiwanie funduszy, EL i CD Wszyscy autorzy przeczytali i wyrazili zgodę na opublikowaną wersję manuskryptu.
Finansowanie
Opłata za przetwarzanie artykułów została sfinansowana przez Ministerstwo Nauki, Badań Naukowych i Sztuki Badenii-Wirtembergii oraz Uniwersytet we Fryburgu w ramach programu finansowania Open Access Publishing.
Oświadczenie o dostępności danych
Dane zawarte są w artykule i Materiałach Uzupełniających .
Przypisy
Uwaga wydawcy: MDPI pozostaje neutralny w odniesieniu do roszczeń jurysdykcyjnych w opublikowanych mapach i powiązaniach instytucjonalnych.
Przedstawiamy tu opracowaną przez genialnego naukowca i badacza z Ukrainy - Borysa Bołotowa substancja bogata .w bakterie kwasu mlekowego i specyficzne enzymy, które stymulują procesy naprawcze i regeneracyjne naprawcze na poziomie komórkowym. 
"Fluor, nadawał się do tego celu znakomicie - nie dość, że wywoływał w umysłach pożądane reakcje, to jeszcze można było uzasadnić jego użycie tym, że chroni zęby. Z trucizny zrobiono lekarstwo."